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(资料图)
脊髓损伤(SCI)后，血-脊髓屏障(BSCB)破新和危险导致血细胞浸润和进行性继发性损伤。因此，早期恢复BSCB是治疗SCI的关键步骤。巴多昔芬（BZA）是第三代雌激素受体调节剂，最近被报道可抑制炎症并减轻创伤性脑损伤引起的血脑屏障破新，引起中枢神经系统损伤和修复领域的极大兴趣。然而，BZA是否可以减轻BSCB破新并有助于SCI修复仍然未知。
近日，来自
上海交通大学附属第六人民医院的徐建广和连小峰团队开发了一种新型生物材料载体，并构建了负载BZA的HSPT（时尚质酸（HA），海藻酸钠（SA），聚乙烯醇（PVA），四甲基丙烷（TPA）材料构建）（HSPT@Be）系统，有效地将BZA输送到SCI现场。HSPT@Be可以在SCI后通过NF-κB途径减弱BSCB的破新，从而揭示其对SCI的潜在治疗益处。相关论文“BiodegradableBilayerHydrogelMembranesLoadedwithBazedoxifeneAttenuateBlood–SpinalCordBarrierDisruptionviatheNF-κBPathwayafterAcuteSpinalCordInjury”于2023年3月1日在线发表于杂志《ActaBiomaterialia》上。
1.水凝胶的制备和表征
首先，研究者构建了负载BZA的HSPT（
HSPT@Be），其中外层由具有活性氧（ROS）响应性的PVA-TPA水凝胶组成，内层由SA，HA和BZA组成的水凝胶层，具有良好的生物安全性（图1A）。图1B验证了聚合物的改性成功。调整内层聚合物的浓度，发现：浓度进一步增加时，由于HA/SA粘度的增加，很难形成均匀的凝胶（图1C）。ROS响应凝胶的降解表明其在1天内表现出降解（图1E）。双层支架的微观形态如图1D所示，内层呈现多孔结构，有利于组织的生长。相比之下，外层更致密，这可以防止药物内层的过早释放。药物释放实验结果表明，药物在大约一周内完全释放（图1F）。多巴胺修饰后，内层可以粘附在要保留的骨表面，通过优化可以调节降解速率。细胞实验表明，HSPT@Be外层的ROS响应水凝胶显着降低了ROS的快速细胞凋亡（图1G）。
图1HSPT@Be水凝胶的制备和表征
2.HSPT@Be促进大鼠SCI后功能恢复
动物实验表明，HSPT@Be显着改善了大鼠后肢的运动功能（图2A）。HE染色评估了每组脊髓损伤的严重程度，HSPT@Be改善了SCI后组织病理结构，效果明显优于BZA组和HSPT组（图2B）。NeuN染色用于评估每组中用白色箭头标记的神经元数量（图2C）。HSPT@Be组的NeuN荧光强度显著高于SCI组、BZA组和HSPT组（图2D）。
图2HSPT@Be通过修复BSCB通透性来促进SCI后的功能恢复
SCI后2天，评估每组BSCB的渗透性。HSPT@Be显著降低了SCI后受伤部位的荧光，这也在脊髓图像中观察到。此外，单独的BZA和HSPT不如HSPT@Be有效（图2E，F）。同样，FITC-葡聚糖荧光强度降低了HSPT@Be（图2G）。因此，HSPT@Be可以抑制SCI后BSCB的破新。
3.HSPT@Be抑制SCI后MMP9表达，增加紧密连接蛋白的表达
SCI后，BSCB破新加剧了中性粒细胞对脊髓的浸润，诱导释放了大量的MMP，导致细胞间紧密连接蛋白的丢失，进一步加剧了BSCB的破新。研究表明，
SCI后紧密连接蛋白ZO-1和封闭蛋白的表达明显降低。HSPT@Be显着抑制了SCI后一天ZO-1和闭塞素表达的降低（图3A-D）。
图3HSPT@Be增加SCI后连接蛋白的表达
BZA，HSPT和HSPT@Be也降低了MMP9表达，并且HSPT@Be的效果比其他处理更显着（图4A-C）。这些结果表明，
HSPT@Be可以抑制MMP9的表达，增加紧密连接蛋白的表达，从而减少对BSCB的损伤。
图4HSPT@Be可减少SCI后脊髓中的MMP和炎性细胞浸润
BSCB损伤后，大量血细胞进入脊髓，引起炎性细胞浸润，诱发SCI后继发性损伤。图4B-D表明，HSPT@Be可以显着减少SCI后脊髓中的炎性细胞浸润，而单独使用HSPT的效果较差。这一发现表明，
从HSPT@Be释放的BZA可以部分恢复SCI后脊髓周围的覆盖支架，并在一定程度上减少炎症细胞浸润，从而减少SCI后的继发损伤。
4.HSPT@Be抑制SCI后NF-κB信号通路的激活和NF-κB易位到细胞核
NF-κB信号通路的激活与上述促炎细胞因子的过表达密切相关。蛋白质印迹结果显示，与SCI组相比，HSPT@Be组p38MAPK和NF-κB的表达水平明显降低（图5A，D），HSPT@Be组中NF-κBp65和p50的表达水平明显低于SCI组（图5B，E）。此外，与SCI组相比，SCI组p65和p50的胞质蛋白表达水平显着降低，HSPT@Be组显着升高（图5C，F）。这些发现表明，
BZA的逐渐释放HSPT@Be发挥了作用，HSPT@Be可以减弱SCI诱导的p65活化增加。在SCI后1天研究氧化应激水平，与SCI组相比，HSPT@Be显着降低了脊髓组织中的MDA水平（图5G）。此外，ELISA结果表明，HSPT治疗导致脊髓组织中SOD2显着降低，HSPT@Be组也有类似的降低，表明HSPT本身可以抑制氧化应激（图5H）。
图5HSPT@Be通过抑制SCI后NF-κB信号通路的激活和NF-κB易位到细胞核来减少炎症
5.HSPT@Be增强OGD后内皮细胞通透性
如图6A所示，BZA在3mg/L浓度下促进细胞增殖的能力最好。培养5、1、2、3和4天后，5组之间无显著差异。图6B显示，
HSMECs生长于HSPT@Be，揭示了HSPT@Be良好的生物相容性和促进BSCB恢复的能力。图6C显示，OGD后细胞通透性显著增强，添加HSPT@Be显著降低。去除BZA后，在OGD条件下内皮屏障的通透性进一步增加。蛋白质印迹法检查了TIMP1和MMP9的表达，与OGD组相比，HSPT@Be处理NF-κB的磷酸化水平显著降低（图6D，F）。此外，HSPT@Be显着增加了TIMP1的表达并降低了MMP9的表达（图6E，G，H）。此外，PCR显示HSPT@Be处理后TIMP1增加，MMP9减少（图6I，J）。
图6HSPT@Be通过抑制NF-κB磷酸化来减少OGD后的内皮细胞炎症
通过免疫荧光分析检查内皮细胞中紧密连接蛋白的表达，结果表明
HSPT@Be可以消除内皮细胞中OGD引起的ZO-1和闭塞素的减少（图7A，B）。
图7OGD后内皮细胞中的紧密连接蛋白增加HSPT@Be
综上，本文使用含有BZA的ROS响应HSPT@Be水凝胶通过减少BSCB在体内和体外的炎症和通透性来治疗SCI。HSPT@Be可以通过机械覆盖减少脊髓炎症并增加BSCB的完整性。
HSPT@Be可以通过BZA的逐渐释放来影响NF-κB，通过一系列复杂的信号通路抑制炎症并修复紧密连接。总之，HSPT@Be膜在SCI后通过NF-κB途径减弱了BSCB的破新。
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